成大研發快訊

現今社會，治療糖尿病及預防其併發症是一個重要的健康課題。不論是第一型或是第二型糖尿病都伴隨著胰島素作用的失衡，包含胰島素缺乏(第一型糖尿病)或是胰島素抗性(第二型糖尿病)。Metformin是一個常用於治療第二型糖尿病的藥物。由於metformin的降血糖作用並非是增加體內的胰島素濃度，因此一般都將metformin視為胰島素增敏劑。Metformin在治療第二型糖尿病上，不僅可以降低血糖，還能夠減輕體重，改善體內高血脂的情形以及改善內皮細胞的作用。因此，metformin不僅可作為降血糖藥物，也可作為預防胰島素抗性形成的藥物。然而，目前仍對metformin詳細作用機轉的了解有限。已知metformin的作用包括抑制肝臟內葡萄糖生成作用及腸道吸收葡萄糖的能力，增加周邊組織利用葡萄糖的能力。文獻指出Metformin會活化肝臟的一個蛋白激酶- AMP-activated protein kinase (AMPK),抑制乙醯輔酶A羧化酶的活性與脂肪生成轉錄因子，並且阻斷了肝臟的糖質新生作用。顯示體內存在另外一條路徑完全不依靠胰島素來調降體內的血糖濃度。過去的研究也發現糖尿病病人或非糖尿病病人，在沒有胰島素作用下，也可由運動的方式可以藉此刺激、活化AMPK的路徑, 進而刺激、增加骨骼肌上的葡萄糖轉運蛋白(GLUT4)的表現，加速葡萄糖的利用率。然而卻缺直接的證據證明AMPK的活化與GLUT4表現有關。

Fig. 1 A: The changes of plasma glucose in STZ-induced diabetic rats that received oral treatment of metformin. B: The change of plasma BER in the same group of animals.

過去的文獻指出，不論給予健康的人或是糖病尿病病人，外給β型腦內啡 (β-endorphin)都可以增加其體內胰島素的濃度。這項研究說明了體內除了胰島素以外，鴉片類胜肽或許就是另一個維持血糖恆定的重要因子。在過去我們實驗室已經證實β型腦內啡 (β-endorphin)在以streptozotocin(STZ)誘發成的糖尿病大鼠(類似人類第一型糖尿病)可以產生降血糖的效果。另外，在以STZ誘發成的糖尿病大鼠以loperamide或tramadol可以活化鴉片類μ型受體，增加了周邊組織對葡萄糖的利用率。在肥胖Zucker鼠的研究中，也發現藉由運動增加體內β型腦內啡的濃度，進而改善已形成的胰島素抗性。這些研究都在在顯示出過去的研究結果顯示出β型腦內啡活化鴉片類μ型受體對改善高血糖具有相當重要的意義。因此，本研究目的是探討metformin是否透過鴉片類μ型受體器官來產生降血糖作用。

在口服Metformin約2至3小時後，才可達血漿中最高濃度。STZ所誘發的糖尿病大鼠其體內的胰島素約只有健康大白鼠的1/20。而metformin仍可在STZ誘發成的糖尿病大鼠產生降血糖作用；顯示metformin的降血糖能力並不需要內生性胰島素的協助。同時也注意到體內β型腦內啡濃度的增加與metformin呈現有劑量相關性(Fig. 1)。而metformin在正常大白鼠與糖尿病大白鼠所產生的降血糖效果是相似的。因此，我們推測metformin所造成的降血糖效果，是與體內胰島素無關，而與β型腦內啡有關。過去已經知道腎上腺是釋放β型腦內啡的周邊組織之ㄧ。因此我們使用雙邊腎上腺切除術，來確定metformin會刺激腎上腺釋放出β型腦內啡。結果發現在摘除腎上腺後的老鼠身上，metformin的降血糖作用就消失了，體內β型腦內啡的濃度也沒有增加 (Table 1)。此外，metformin可以刺激取自糖尿病大鼠的離體腎上腺分泌出β型腦內啡 (Fig. 2).

Fig. 2 Effect of metformin on BER secretion from the isolated adrenal medulla of STZ-induced diabetic rats.

因此，我們推論刺激腎上腺分泌出β型腦內啡對於metformin降血糖作用是重要的。β型腦內啡主要是透過活化鴉片類μ型受體來進行調控。鴉片類μ型受體主要是分布在一些特化的痛覺傳遞神經元上，包含有脊髓和脊髓以上的神經元。而我們發現β型腦內啡可以刺激STZ所誘發的糖尿病大鼠其肌肉上葡萄糖吸收作用以及抑制肝臟組織糖質新生的能力，達到降血糖的效果。β型腦內啡可以被naloxone和naloxonazine兩種鴉片類μ型受體拮抗劑所抑制。因此進一步使用naloxone和naloxonazine兩種鴉片類μ型受體拮抗劑進行驗證metformin的降糖作用是否是透過β型腦內啡。結果發現，經前處理naloxone和naloxonazine兩種受體拮抗劑後，metformin的降糖作用就消失了(Table 2)，證明β型腦內啡對於metformin降糖作用的重要性。更進一步的利用已剔除鴉片類μ型受體的小鼠作為驗證鴉片類μ型受體對metformin作用的重要性。結果顯示metformin無法在已剔除鴉片類μ型受體的小鼠身上產生降血糖作用。這個結果顯示鴉片類μ型受體對metformin降血糖作用的重要性(Fig. 3)。

Fig. 3 A: The change of plasma glucose in opioid µ-receptor knockout diabetic mice and wild-type controls receiving an oral intake of metformin (100 mg/kg). B: The plasma BER in same group of mice.

糖尿病的其中一個特徵就是肝臟的糖質新生作用增加以及週邊組織對葡萄糖利用率下降。而Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)是一個肝臟糖質新生作用的關鍵酵素，第一型糖尿病在缺乏胰島素調控下，其肝臟PEPCK的表現會增加。此外，糖尿病大鼠骨骼肌上GLUT4的表現量下降，也是肌肉組織對於葡萄糖利用率下降的主要原因。重複給予STZ誘發成的糖尿病大鼠metformin三天後，可以增加大鼠骨骼肌上葡萄糖轉運蛋白GLUT4的基因表現，以及抑制肝臟PEPCK的基因表現。而這個現象都可以藉由使用naloxonazine給阻斷(Fig. 4)。Metformin對於肝臟糖質新生作用的關鍵酵素PEPCK基因表現的調控較為顯著，這項結果與過去認為metformin的降血糖作用是增加週邊組織對葡萄糖的利用率與抑制肝臟糖質新生的作用是一致的。過去已經知道phospholipase C (PLC)與Protein kinase C (PKC)對於鴉片類受體的訊息傳遞是重要的，而PLC-PKC的磷酸化路徑對於GLUT4的作用也很重要，然而鴉片受體是否是透過PLC-PKC這條路徑來調控GLUT4則仍待更進一步的研究來證明。肝臟PEPCK基因的表現，可被許多荷爾蒙所調控；而本研究發現PEPCK基因的表現會受到鴉片類受體拮抗劑所抑制，顯示PEPCK基因也有可能受到鴉片類受體的影響，然而其詳細的作用機轉仍需進一步的研究證實。

綜合上述實驗結果，我們提出metformin的降血糖作用可以藉由刺激腎上腺釋放β型腦內啡，活化週邊組織鴉片類μ型受體來產生降血糖作用，進而增加骨骼肌上葡萄糖轉運蛋白的基因表現以及抑制肝臟PEPCK的基因表現。我們的研究對於metformin的作用機轉提出了一個新的研究方向。

Fig. 4. Representative images indicating the mRNA level for GLUT-4 or ß-actin in soleus muscle (A), the protein level for GLUT-4 or actin in soleus muscle (B), the gel electrophoresis of RT-PCR for PEPCK from the liver (C), and the protein level for PEPCK or ß-tubulin in liver (D). Lane 1: Vehicle-administered normal rats. Lane 2: Vehicle-administered STZ-induced diabetic rats. Lane 3: Metformin-treated STZ-induced diabetic rats. Lane 4: Metformin plus naloxonazine-administered STZ-induced diabetic rats.