第十二卷 第九期 - 2010年二月二十六日 PDF
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微型胞膜電穿孔基因轉殖晶片最佳化之研究
楊勝仲1, 2、黃耿祥1、陳泓毅1林裕城1, 3*
1國立成功大學工程科學系
2金屬工業研發中心
3國立成功大學微奈米中心
 
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膜電穿孔(Electroporation)技術原理為利用極短時間的大脈衝電場,使細胞膜短暫產生一些微小孔隙,讓親水性的極性分子較容易通過細胞膜;常應用在傳送外物質進入原核與真核生物細胞,而常見的外物質有RNA、DNA、藥物以及蛋白質傳送進細胞。本研究提供一非病毒之轉殖技術,將質體DNA pEGFP-N1或金奈米/寡核甘酸以胞膜電穿孔技術,轉殖進入哺乳動物細胞。且應用低電壓轉殖,藉由晶片反應槽內之微小陣列結構,所造成的尖端放電效應,來提昇反應槽內之電場強度,進而大幅度提高轉殖效率與殘存率,並利用田口品質分析實驗方法,來評估實驗參數,提高轉殖效率。

可逆性的電崩潰的過程是當電脈衝刺激細胞膜時,會產生可逆性電崩潰(Reversible electrical breakdown, REB)的現象,如圖1所示。可逆性電崩潰導致細胞膜瞬間放電,胞膜產生大量暫時性的孔洞,由於此時細胞與外界之間仍然有化學成分的作用,使得細胞承受了應力,胞膜和胞器都有可能受損,造成細胞永久性的傷害甚至死亡;在脈衝結束,電場消失後,穿膜電位回復至穩定狀態,胞膜恢復原來的無破裂的情況或少量的孔洞;而無破裂的情況,是實驗中最期望的情況,如此轉殖實驗之後才有較高的存活率。
圖2 懸浮式胞膜電穿孔晶片:(a) 整體結構分解圖,(b) 金屬電極光罩設計圖,(c) 金屬電極光罩局部放大設計圖。
圖1 胞膜穿孔法示意圖:(a) 胞膜可逆性的電崩潰的過程,(b) 帶負電的DNA受到細胞膜電穿孔微晶片系統之作用,會被吸引進入細胞內。

藉由微機電技術可以在相當的表面積中製造大量且精確的微電極,利用此技術開發出懸浮式微型胞膜電穿孔轉植晶片,如圖2所示。基板採用了68 mm × 25 mm的玻片,於上設計一個反應電極,晶片整體為兩片反應電極基板與PDMS(Polydimethyl siloxane)反應槽組裝而成。反應電極包含鈦(Titanium, Ti)薄膜與金(Gold, Au)薄膜兩層;由於金對玻璃的附著性較差,而鈦對玻璃與對金均有良好的材料附著性,所以在玻璃基板先鍍上一層Ti,增加金的附著效果。反應區電極的梳狀(Interdigitated)結構線寬區分為三型,A型為50 μm電極寬度與其間距,B型為100 μm電極寬度與其間距,C型為200 μm電極寬度與其間距;PDMS反應槽的容積為100 μL。

以電腦輔助分析方法來對結構進行數值模擬,採用CFDRC™(CFD research corporation, Alabama, U.S.A.)套裝軟體進行模擬,而模擬的目的是希望藉由運算求得的空間電場分布,推得帶電離子受電場力運動的情形;進而分析轉殖結構設計是否適當。CFDRC™套裝軟體中的CFD-GEMO模組,其除了提供主要的結構模型離散化功能外,也附加二維與三維模型建構功能,方便使用者不用再另尋其它軟體建構模型;模型離散化的方法是採用二維正交元素(Element)切分二維晶片模型,且採用程式中的Power law選項,使得在靠近各邊界的地方,Elements切分的較為密緻;考量Elements總數目不宜太大的情況下,取反應槽的局部來建構整個二維模組;A型(50 μm電極寬度與其間距)其總節點數(Nodes)為92175個、而Elements為91624個;B型(100 μm電極寬度與其間距)其總節點數(Nodes)為84291個、而Elements為82919個;C型(200 μm電極寬度與其間距)其總節點數(Nodes)為75611個、而Elements為73268個;如圖4(b)所示為晶片模型離散化示意圖。對於懸浮式胞膜電穿孔晶片之電場二維穩態數值模擬,分別針對圖4(a)所示的結構Z軸方向,切D-D、E-E及F-F剖線,做電場梯度的探討,從模擬結果圖4(c)-(e)中可發現,雖然電極與其間距為50 μm,其電極尖端放電所造成的最大電場沒有比100 μm與200 μm大,但其剖線所量測到的電場強度,越接近反應槽中心,其電場強度卻是比100 μm與200 μm高,且均勻性更好。圖4(f)為A型電極X-Z平面的電廠分佈圖。
圖4 電場模擬分佈:(a) 電極示意圖,(b) 離散化示意圖;剖線的電場分佈(c) D-D剖線,(d) E-E剖線,(e) F-F剖線,(f) A型電極X-Z平面的電場分佈(輸入電壓:3 V)。
圖3 懸浮式胞膜電穿孔晶片之基因轉殖系統。
表1 懸浮式胞膜電穿孔晶片應用於螢光基因轉殖的控制因子及水準表

對於懸浮式胞膜電穿孔晶片應用於螢光基因轉殖之效率評估,圖3為基因轉殖系統,其實驗設計與規劃是採用田口式品質工程設計實驗法輔助之;經本實驗室歷年來的相關實驗經驗,與實驗設備器材所能提供的參數,決定出四個控制因子,而每個控制因子又有三個水準,如表1所示。其中A因子(電極疏密)表示晶片反應電極的大小的差異,B因子表示加入反應槽之pEGFP-N1濃度的差異,而C與D因子表示脈衝電源供應器所能提供胞膜電穿孔的電壓大小與脈衝數;而實驗採用的細胞株為小鼠纖維母細胞(NIH-3T3)。依表一決定的控制因子及水準表,我們選用了L9(34)直交表,來進行轉殖實驗的規劃,而對於基因轉殖的品質特性是屬於望大特性(Larger-the-best),也就是轉殖率(Ω)越大越好(如表2所示),計算方法如以下公式(1)、(2):

Ω by:
(1)

(2)

表2 因子對轉殖率的反應表

圖5 因子對轉殖率的反應圖。
圖5是針對平均轉殖率品質特性的因子反應圖,也從圖5找出一組最佳實驗參數: A1, B3, C2, D1,但是從表2可知道控制因子A、C、D的轉殖率皆超過6 dB,但是B因子只有2.89 dB,所以可以判定B因子對變異是不具影響力的因子,而且此因子所引起的變異被認為可能是實驗誤差所造成的「偶發現象」;而此「偶發現象」我們大膽假設為,晶片設計應用了樣本預濃縮技術,造成在質體濃度上是無意義的,也就是說pEGFP-N1濃度使用最低20 μg/mL或最高80 μg/mL轉殖效果應無差異太大;因此在確認實驗方面將設定B因子為水準1,所以改變最佳參數: A1, B1, C2, D1,即pEGFP-N1濃度由80 μg/mL降為20 μg/mL;實驗所得結果如表3所示。
表3 確認實驗表

由圖6(a)的A×C、A×D、C×D三個3水準交互作用圖可知,因子A、C、D在水準3時有很強的交互作用,而在水準1或2交互作用明顯較弱,因此可忽略水準3的交互作用,將3水準的交互作用圖改為2水準的交互作用圖,如圖6(b)所示。而我們所設定的最佳化水準A1, B1, C2, D1皆為水準1與水準2,由田口方法預測的轉殖率為43.67%,而我們所進行的三次確認實驗的平均轉殖率為40.36%,如表3所示,雖然下降了3.31%,但可以知道預測值與實驗值有很好的一致性,而且轉殖率由原始設計的17.2%提升到了40.36%。圖7所示為預測實驗與確認實驗於螢光顯微鏡下之比較。
圖7 原始設計與最佳化實驗於螢光顯微鏡下之比較,(a) 原始設計之結果,(b) 最佳化之結果。
圖6 交互作用圖:(a) 3個水準,(b) 2個水準。

本研究成功的由模擬結果得知,利用微機電製程技術製作出的梳狀微電極陣列,可降低工作電壓、減少樣本的使用量,並經實驗證明,懸浮式晶片雖應用單純電脈衝機制,但也藉由高密度的平面電場,提高了細胞的轉殖表現,也就是說其轉殖率大致與尖端放電出現的機會或密度呈正相關。在螢光轉殖部分,使用了田口式品質工程設計實驗法輔助之,利用最少之實驗次數,找到了最佳實驗參數組合條件,進而在最佳實驗參數組合條件下證明了轉殖率與尖端放電區域多寡、pEGFP-N1濃度呈正相關,而脈衝電壓大小則與細胞特性有關;而使用2個電脈衝數,能有最好轉殖率。另外,DNA可結合奈米粒子之應用,目前奈米生醫材料幾乎包括所有生化藥品,奈米生醫材料的微小及易滲透的特性,使得醫藥學家有可能改變細胞基因,科學家可以藉此對生物體內生物分子的活動進行探查,以找到影響人類健康的某些答案,奈米科技的發展必將會為生物科技的發展帶來無限的希望。
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